ПЦР (исследование) - приложение. Что такое метод ПЦР?

ПЦР - это тест, который использовался для диагностики многих заболеваний. Метод ПЦР позволяет показать прямое присутствие бактерий в организме, в частности, их ДНК. Среди прочего, используется ПЦР-тестирование. в диагностике болезни Лайма. Что такое метод ПЦР? Что такое ПЦР в реальном времени?

Оглавление:

1. ПЦР (тестирование) - что такое метод ПЦР?
2. ПЦР (исследование) - применение метода ПЦР
3. ПЦР (исследование) - болезнь Лайма
4. ПЦР (исследование) - результаты. Могут ли они быть ложными?
5. ПЦР (исследование) - результаты. Могут ли они быть ложноотрицательными

ПЦР (полимеразная цепная реакция) - основной метод, используемый в генетических и молекулярных лабораториях. Он был разработан в 1983 году Кара Муллис, которая в 1993 году была удостоена за это Нобелевской премии.

Узнайте, что такое метод ПЦР. Это материал из цикла ХОРОШЕЕ СЛУШАНИЕ. Подкасты с советами.

Для просмотра этого видео включите JavaScript и рассмотрите возможность обновления до веб-браузера, поддерживающего видео HTML5.

ПЦР (тестирование) - что такое метод ПЦР?

ПЦР-тестирование состоит из многократной амплификации (обычно за 30-40 циклов) определенного фрагмента ДНК, например генов, кодирующих белки Borrelia, с использованием фермента полимеразы.

Затем используются специальные молекулярные красители, чтобы сделать видимым амплифицированный фрагмент ДНК. ПЦР, благодаря амплификации определенных фрагментов ДНК, является сверхчувствительным методом.

В методе ПЦР фрагменты ДНК амплифицируются с использованием конкретных пар праймеров для данной области бактериальной ДНК. Например, области-мишени в ПЦР, используемой для диагностики болезни Лайма, представляют собой гены, кодирующие белки, например 16S рДНК, recA, fla, p66, OspA.

Биологический материал, из которого может быть проведен тест:

• кровь
• участок кожи от мигрирующей эритемы
• спинномозговая жидкость
• синовиальная жидкость или из суставного хряща
• моча

ПЦР (исследование) - применение метода ПЦР

В дополнение к диагностике боррелиоза Лайма с помощью метода ПЦР можно обнаружить специфические фрагменты ДНК других микроорганизмов или человека. Поэтому метод ПЦР также используется:

• диагностика и мониторинг вирусных инфекций: вирусы герпеса (вирус герпеса, вирус опоясывающего лишая, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус), ВИЧ, вирусы гепатита (HBV и HCV)
• диагностика и мониторинг бактериальных инфекций, особенно тех бактерий, которые не могут быть идентифицированы с помощью культур, например туберкулеза
• диагностика и мониторинг опухолевых заболеваний: лейкозов, рака груди, колоректального рака, рака легких
• диагностика предрасположенности к раку: рак груди и яичников (гены BRCA1 и BRCA2), рак толстой кишки (гены APC и CHEK2)
• диагностика генетических заболеваний: гемохроматоз (ген HFE), талассемия (гены HBA1 и HBA2), целиакия (гены HLA)
• тесты на отцовство, которые определяют совместимость ДНК ребенка и отца

Также прочтите: Тесты на болезнь Лайма - как они выглядят и какова цена тестов на болезнь Лайма Вестерн-блоттинг и болезнь Лайма. Интерпретация результатов тестов Клещевые болезни: болезнь Лайма, бабезиоз, бартонеллез, клещевой энцефалит и другие.

В настоящее время существует множество модификаций метода ПЦР. Например, в диагностике боррелиоза Лайма в основном используются вложенная ПЦР и ПЦР в реальном времени. Последний метод является количественным и позволяет определить точное количество копий ДНК боррелий в исследуемом биологическом материале.

ПЦР (исследование) и болезнь Лайма

Серологические тесты являются основой для диагностики болезни Лайма. Однако есть клинические ситуации, при которых эти тесты могут быть ложноотрицательными:

• серологическое окно, то есть начальный период инфекции, когда организм еще не вырабатывает специфические антитела IgM и IgG к спирохетам Borrelia
• у людей с иммунодефицитом, которые не вырабатывают достаточно антител
• наличие иммунных комплексов, состоящих из антигенов Borrelia spirochetes и специфических антител к ним и препятствующих обнаружению антител серологическими методами

Если у пациента подозреваются симптомы болезни Лайма и результаты серологического анализа отрицательны, можно провести молекулярные тесты на основе метода ПЦР.

ДНК спирохет Borrelia может быть обнаружена на ранней стадии инфекции, поскольку количество спирохет в биологических жидкостях тогда является самым высоким.

При диагностике боррелиоза Лайма в основном используются серологические методы, такие как ELISA, но в некоторых клинических ситуациях полезны генетические тесты с использованием метода ПЦР.

Чем дольше время от заражения, тем меньше вероятность обнаружения бактериальной ДНК. Поэтому в некоторых случаях перед проведением ПЦР-теста бактерии выращивают на специальной среде в течение 1-2 недель, а затем проводят тест.

Такой подход используется в случае подозрения на болезнь Лайма и забора спинномозговой жидкости. На поздней стадии заражения более целесообразно провести тест ELISA.

Метод ПЦР не следует использовать в рутинной диагностике боррелиоза Лайма из-за отсутствия стандартизации в отношении встречаемости разновидностей Borrelia burgdorferi в Польше.

Однако в случае затруднений в диагностике (особенно на ранней стадии заболевания) результат ПЦР-теста помогает в диагностическом процессе.

Положительный результат теста означает, что в исследуемом материале было обнаружено присутствие ДНК Borrelia burgdorferi и ее разновидностей, но не объясняет, происходит ли в организме активная инфекция. С другой стороны, отрицательный результат не исключает наличия бактерий в организме.

Некоторые лаборатории предлагают тестирование на наличие ДНК боррелий в клещах. Однако результат такого обследования не является основанием для диагностики болезни Лайма у укушенного человека.

Рекомендуемая статья:

ИФА - что он определяет? Как читать результаты? Стоимость теста

ПЦР - результаты. Могут ли они быть ложными?

ПЦР - сверхчувствительный метод и в то же время очень чувствительный к загрязнениям. Поэтому в тестах на основе ПЦР очень важно выбрать соответствующий внутренний контроль, чтобы исключить ложноположительные результаты.

Ключевым моментом является также правильный сбор материала для тестирования, а также опыт и надежность диагноста, выполняющего тест.

ПЦР - результаты. Могут ли они быть ложноотрицательными

Как и в любом лабораторном тесте, также в методе ПЦР могут появиться ложноотрицательные результаты. Здесь очень важно собрать кровь на соответствующий антикоагулянт, потому что некоторые из них, например гепарин, могут подавлять реакцию ПЦР.

Также сбор материала после начала антибактериальной терапии может вызвать снижение эффективности реакции ПЦР и большую вероятность ложноотрицательных результатов.

Также следует помнить, что бактерии Borrelia очень недолго живут в крови и биологических жидкостях, поскольку благодаря специальным рецепторам они очень быстро проникают в «труднодоступные» места тела.

Поэтому, в отличие от диагностики других микроорганизмов, количество спирохет Borrelia в биологическом материале невелико, иногда даже на пределе обнаружения методом ПЦР. Это также может вызвать ложноотрицательный результат.

Рекомендуемая статья:

Тест трансформации лимфоцитов (LTT)

Литература

1. Дунай Дж. И др. Важность метода ПЦР в диагностике боррелиоза Лайма. Просматривать Эпидемиол. 2013, 67, 119 - 123.
2. Лабораторная диагностика клещевых заболеваний. Рекомендации рабочей группы: Национальная палата лабораторных диагностов, Национальный институт общественного здравоохранения - Национальный институт гигиены, Национальный консультант в области инфекционных заболеваний, Отделение инфекционных заболеваний и нейроинфекций, Медицинский университет Белостока, Польское общество вирусологии, Варшава, 2014.
3. Ружич-Саблич Э. и Церар Т. Прогресс в молекулярной диагностике болезни Лайма. Эксперт Rev Mol Diagn. 2017 Янв; 17 (1): 19-30.
4. Валонес М.А.А. и др. Принципы и применения полимеразной цепной реакции в областях медицинской диагностики: обзор. Braz J Microbiol. 2009 январь-март; 40 (1): 1-11.

Об авторе

Каролина Карабина, доктор медицинских наук, молекулярный биолог, лабораторный диагност, Cambridge Diagnostics Polska. Биолог со специализацией в микробиологии и лабораторный диагност с более чем 10-летним опытом лабораторной работы. Выпускник Школы молекулярной медицины и член Польского общества генетиков человека, руководитель исследовательских грантов в лаборатории молекулярной диагностики при отделении гематологии, онкологии и внутренних болезней Варшавского медицинского университета. Защитила звание доктора медицинских наук в области медицинской биологии на 1-м медицинском факультете Варшавского медицинского университета. Автор многих научных и научно-популярных работ в области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и питания. Ежедневно, как специалист в области лабораторной диагностики, он руководит основным отделом Cambridge Diagnostics Polska и сотрудничает с командой диетологов в CD Dietary Clinic. Он делится своими практическими знаниями по диагностике и диетотерапии заболеваний со специалистами на конференциях, тренингах, в журналах и на сайтах. Особенно ее интересует влияние современного образа жизни на молекулярные процессы в организме.